植物生长素转运机制研究取得进展

【来源:中科院之声】

8月2日，中国科学技术大学生命科学与医学部教授孙林峰团队在《自然》(Nature)上，发表了题为Structural insights into auxin recognition and efflux byArabidopsisPIN1的研究论文，报道了植物中生长素极性转运蛋白PIN1，以及它分别与底物生长素(IAA-bound)、抑制剂NPA(N-1-naphthylphthalamic acid，又名抑草生)结合的(NPA-bound)三个高分辨率结构，并结合功能实验阐释了PIN1蛋白的工作机制，为剖析植物生长素运输调控以及针对PIN蛋白的农业用除草剂和植物生长调节剂的设计开发奠定了重要基础。

在功能分析的同时，研究团队利用HEK293F细胞瞬时表达系统表达、纯化得到了拟南芥PIN1蛋白。为了解决蛋白构象不稳定及分子量较小的问题，孙林峰团队与中科院分子细胞科学卓越创新中心李典范团队合作，利用体外纳米抗体合成技术，得到大量靶向PIN1蛋白的纳米抗体，进一步通过亲和力、热稳定性分析缩小了抗体筛查范围。最终，研究利用冷冻电镜单颗粒重构技术，解析了PIN1与一种纳米抗体结合的、分辨率为3.0埃的结构，首次揭示了经典PIN家族蛋白成员的样貌。PIN1以对称性的同源二聚体方式组装。每个PIN1单体具有10次跨膜螺旋，呈现出典型的NhaA蛋白折叠方式，划分为Scaffold结构域和Transporter结构域。PIN1呈现向细胞质侧开放的构象，同时，胞质侧有一个由b折叠片组成的结构域，区别于近期报道的同家族成员PIN8蛋白的结构。通过在蛋白中添加底物IAA和抑制剂NPA，研究又分别得到了PIN1蛋白分别与两种小分子结合的复合物结构。在这些结构中，科研人员清楚地观察到IAA和NPA结合的结合位点以及相互作用氨基酸残基，并通过突变、ITC结合常数测定和转运分析验证了这些残基的重要性。虽然IAA和NPA在结合方式上具有一定相似性，但由于NPA分子更大，通过与PIN1产生更多的氢键和疏水性相互作用，以一种亲和力更高的方式结合，并使蛋白处于朝内侧开放的构象，从实验上验证了NPA的高效抑制作用。此外，研究探讨了PIN家族蛋白转运IAA的驱动力和能量来源，转运实验分析发现跨膜质子梯度对于IAA运输影响较小，暗示PIN不依赖质子梯度提供能量。

该研究揭开了植物经典PIN家族蛋白的结构面纱，系统阐释了PIN1识别底物生长素IAA以及被NPA抑制的分子机制，为科学家阐释植物生长素极性运输过程提供了重要帮助，为基于靶向该家族蛋白的小分子抑制剂设计奠定了基础，并对指导农业应用具有重要意义。

1880年，达尔文父子在《植物的运动力》(The Power of Movements in Plants)中提出了植物茎顶端会产生某种物质导致“向光性”生长的猜想。1928年，荷兰科学家F.Went通过“温特实验”(燕麦胚芽鞘弯曲实验)证实了这种物质的存在并首次提出了“生长素”的概念。科学家的进一步研究确定植物中主要的生长素为吲哚-3-乙酸(IAA，Indole-3-acetic acid)。作为第一种被发现的植物激素，生长素几乎参与了植物生长发育调控的每一个过程，例如胚胎发育、根发育、叶发育、花发育、向光性和向重力性等。区别于其他植物激素，生长素的一个显著特点是其细胞与细胞间的运输过程具有方向性，这一过程称为生长素极性运输(Polar Auxin Transport，PAT)。生长素极性运输通过与其合成和代谢途径共同配合，产生浓度梯度和局部浓度差异，建立调控植物生长发育、“向性生长”的基础，响应内外界信号刺激。在生长素极性运输过程中，位于膜上的转运蛋白发挥了关键作用，其中生长素外排蛋白家族PIN(PIN-FORMEDauxin exporter)尤为重要。研究表明，PIN蛋白成员在细胞质膜上具有不对称分布的特点，其极性定位与生长素运输方向高度关联，是生长素在植物体内不对称分布的重要原因。由于缺乏精细的三维结构，PIN家族蛋白特异性识别、转运生长素的机制未知，这是生长素研究领域亟待解决的关键科学问题。NPA是之前实验室广泛应用的一种生长素极性运输抑制剂，也是农业生产中最早作为除草剂应用的化学小分子。生化证据表明，NPA可以直接靶向PIN蛋白，但如何发挥作用尚不清楚。

拟南芥PIN1蛋白三种状态下的结构和转运机制示意图

在模式植物拟南芥中，PIN家族包括8个蛋白成员，即经典的、主要分布于细胞膜上的、具有较长胞质loop环的PIN成员(PIN1~PIN4和PIN7)，非经典的、分布于内质网上的、具有较短胞质loop环的PIN成员(PIN5和PIN8)，以及胞质loop环长度介于二者之间的PIN6蛋白。PIN1是最早鉴定的PIN家族成员之一，其基因突变导致植物产生裸露的针状(pin-formed)花序，该家族由此得名。本研究中，孙林峰团队针对PIN1这一经典的PIN家族成员展开研究，搭建了一套全新的基于放射性同位素和哺乳动物HEK293T细胞的检测PIN1蛋白生长素外排功能的生化体系，验证了其转运活性，证实了PIN1受蛋白激酶激活调控、被NPA抑制的过程，并为PIN介导的生长素运输机制研究提供了可靠的便捷手段。此外，科研团队利用质谱分析技术，鉴定了多个位于胞质loop环的磷酸化位点，为进一步探究PIN受磷酸化调控的机制提供了线索。

文章来源：《植物研究》 网址: http://www.zwyjzz.cn/zonghexinwen/2022/0809/2427.html